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技術文章

使用 Lumicounter 的抗氧化作用測量方法

使用 Lumicounter 的抗氧化作用測量方法

通過呼吸作用進入體內的大約 3% 的氧氣在電子傳遞鏈的能量代謝過程中被還原為超氧陰離子 (O2-)、過氧化氫 (H2O2)、羥基自由基 (.OH) 和單線態(tài)氧 (1O2) 和其他活性氧。已經指出,這些活性氧使蛋白質變性并破壞DNA中的抗癌基因,從而引起癌變。

另一方面,人體有清除活性和抗氧化物質,如抗壞血酸和α-生育酚等,如超氧化物歧化酶(SOD)可將氧氣清除。近年來,尋找具有抗氧化能力的物質,如兒茶素和異黃酮等多酚類物質,以及作為它們的輔助物質的物質受到關注,并且正在進行對其能力的分析。在這里,我們總結了使用化學發(fā)光測量自由基清除能力的方法作為抗氧化能力的測量方法。


圖1 活性氧的產生與去除

原則

化學發(fā)光

化學發(fā)光是由發(fā)光底物的氧化引起的。使用金屬離子或鐵等絡合物作為催化劑,魯米諾被 H2O2 氧化,形成 3-氨基鄰苯二甲酸。此時首先成為激發(fā)單重態(tài),成為基態(tài)后發(fā)出藍色光。


魯米諾反應

抗氧化能力評價

通過測量發(fā)光底物的目標物質對發(fā)光的氧化抑制,可以測量目標物質的抗氧化能力。作為抗氧化能力的指標,有一種方法可以檢查酶反應產生的自由基的自由基清除能力。另外,在ESR(電子自旋共振)方法中,產生的自由基被DMPO捕獲并測量為自由基強度。因此,間接追蹤超氧化物的消除,而發(fā)光測量直接測量活性氧裂解時產生的發(fā)光,因此可以說是一種更直接的測量方法。

次黃嘌-黃嘌氧化酶-O2-的底物,是酶促反應產生的一種活性氧,用魯米諾、光澤精或Cypridina熒光素衍生物等使之發(fā)光,用發(fā)光量計測定發(fā)光量。發(fā)光計數(shù)器。此時計算抑制率(抑制率(%)=1-B/A×100),其中A為未添加抗氧劑時的發(fā)光量,B為添加抗氧劑時的發(fā)光量. 可以推斷,抑制率越高,抗氧化效果越高。另外,根據(jù)SOD的抑制率,將每單位重量樣品的抑制率換算成等量的SOD,可以進行定量測定。


圖2 抗氧化作用測量原理

次黃嘌0-黃嘌0氧化酶系統(tǒng)中的 O2- 產生

抗氧化能力測定例

O2- 由次黃嘌0-黃嘌0氧化酶反應產生,并使用發(fā)光試劑發(fā)光。添加抗氧化劑作為樣品并獲得抑制率。

■ 試劑

  • KH2PO4 緩沖液 (0.1M-KH2PO4-0.05mM-EDTA)

  • 黃嘌0溶液(3.6mM-次黃嘌0/KH2PO4 緩沖液)

  • 黃嘌0氧化酶溶液(100μg/mL-黃嘌0氧化酶溶液)

  • 發(fā)光試劑

■ 測量

使用 Lumicounter 進行測量。由于是高靈敏度的微弱光測量儀,請避開窗戶等有直射光的地方,并注意濕度。NU-700 可以在微型管中進行測量。此外,NU-2500具有攪拌功能,通過每隔一定時間反轉并稍微偏離旋轉軸中心的攪拌裝置,即可有效攪拌樣品。


圖 3 Lumicounter NU-2500

(A)未添加抗氧化劑的微管

  • 發(fā)光試劑

  • 黃嘌0氧化酶溶液

  • KH2PO4緩沖劑

 

被分配并設置在設備中。從自動移液器中分裝黃嘌0溶液并測量積分發(fā)光值一分鐘。

(B)添加到微管中的抗氧化劑

  • 發(fā)光試劑

  • 抗氧化劑

  • 黃嘌0氧化酶溶液

  • KH2PO4緩沖劑

被分配并設置在設備中。從自動移液器中分裝黃嘌0溶液并測量積分發(fā)光值一分鐘。

應用領域

抗氧化能力測量活性氧測量用于以下領域。

  • 新型功能性食品的研發(fā)
    水稻過氧化物酶活性的測定 稗子中 自由基
    清除成分的測定
    過氧化氫對發(fā)芽 生根的影響

  • 醫(yī)學領域
    活性氧在體內作用機制的闡明
    體內氧化應激
    的測量 灌注系統(tǒng)中NO的測量 肝損傷
    枯否細胞 的
    活性生產能力

  • 分析化學
    發(fā)光試劑的開發(fā)
    測量方法的開發(fā)
    分子探針的開發(fā)

  • 其他
    光催化反應產生的
    活性氧的測量
    魚類中性粒細胞
    活性氧產生能力的比較魚種間牛乳腺炎
    化學發(fā)光早期診斷

除了測量活性氧之外, Lumicounter還可用于多種用途,例如以下用途。

  • 使用報告基因的分析使用
    報告基因的基因轉錄和表達功能分析(啟動子、增強子等的活性分析)

    1. 熒光素酶測定
    2. 使用磷酸酶
    進行分析 3. 使用 β-半乳糖苷酶進行分析

  • 通過 ATP 測量測量細菌和細胞計數(shù)

    1. 食品、廢水、土壤等中生物量的測量
    2. 食品工業(yè)工作場所的衛(wèi)生檢查
    3.通過測量細胞中的
    ATP來調查細胞活性
    4. 細菌和酵母等微生物的細胞計數(shù)測量
    5.種子、植物生長率測定等

  • NAD(P)H系統(tǒng)發(fā)光信號的測量與分析
    來自發(fā)光細菌的熒光素酶在存在下催化還原的黃素單核苷酸和6-8個碳鏈的長鏈醛氧化成長鏈脂肪酸的反應酶。發(fā)光發(fā)生。

    1. NAD(P)H 定量
    2. FMN 定量
    3. 酶聯(lián)免疫分析

  • 應用化學發(fā)光
    魯米諾、光澤精等化學發(fā)光。

    1.化學發(fā)光法檢測吞噬活性2.
    水母
    蛋白測定Ca2+濃度3.化學
    發(fā)光法定量Ach(乙酰膽堿)



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